Заглянем в будущее. За пределами обыденного

«Зуб - настоящее чудо дизайнерского искусства, сотворенное природой. У человека на его формирование уходит минимум 14 месяцев…»
(Из обзорной статьи Пола Шарпа и Конана Янга «Зубы из пробирки»)

Специалисты в области тканевой инженерии (ТИ) надеются сконструировать полноценные зубы для замены утраченных уже в недалеком будущем, и не только в лабораторных экспериментах: в биоконструировании ученые уже добились определенных успехов, получив правильные в структурном отношении зубы.

На переднем крае зубной инженерии существуют 2 альтернативных подхода к созданию полноценных зубов, заменяющих утраченные. Изучая законы Природы сторонники обоих направлений пытаются воспроизвести подобные условия и смоделировать подобные сценарии естественных процессов роста зубов.

1. Имитация процессов, происходящих на эмбриональном уровне
2. Создание зубов из уже существующих клеток зубной ткани или выращивание таких клеток из тканей-предшественников

Пока нерешенными для биоконструирования зубов человека остаютсяпроблемы образования корней и идентификации идеального исходного материала. Однако, прогресс в области тканевой инженерии столь стремителен, что, возможно, полноценный зуб станет первым органом, выращенным в пробирке (и уже в недалеком будущем ожидаются успехи в регенерации более крупных органов). По крайней мере, оптимизм ученых вдохновляет и пациентов, лишившихся зубов, жаждущих вновь их заиметь на прежних местах; и практических врачей, желающих дать пациенту шанс обрести новые эстетически и функционально совпадающие зубы, взамен утерянных. По мнению идеолога выращивания новых зубов у пациентов - Пола Шарпа, «ключевое преимущество будет заключаться в том, что зуб получится живым, работоспособным, и окружающие ткани не будут страдать так, как от искусственных протезов».

Некоторые нюансы проводимых исследований в этой области приоткрывают Пол Шарп (Paul Т. Sharpe) и Конан Янг (Conan S. Young) в своем обзоре «Зубы из пробирки» (см. www.sciam.ru).

Пол Шарп - профессор Королевского колледжа (Лондон), возглавляет отдел по изучению развития лицевой части головы в госпитале Гая в Лондоне. В 2002 г. он создал биотехнологическую компанию Odontis Ltd, основным направлением работы которой стало выращивание зубов и костей человека путем воспроизведения процессов их формирования у эмбриона.

Конан Янг - штатный научный сотрудник Института Форсайта в Бостоне, преподает в Гарвардской стоматологической школе, занимается конструированием зубов с использованием биодеградируемых каркасов.

Пол Шарп и Конан Янг впервые встретились в 2002 г. на Конференции по биоинженерии зубов и костей.

В международной прессе последних лет делались очень смелые заявления представителей СМИ. Представим слово авторам и познакомим читателей с некоторыми фрагментами из их совместного обзора.

Зуб - настоящее чудо дизайнерского искусства, сотворенное природой. У человека на его формирование уходит минимум 14 месяцев. В закладке зубов у эмбриона участвуют ткани двух типов; между их клетками происходит непрекращающийся диалог. Специалисты по тканевой инженерии тщательно исследуют этот поток информации, чтобы использовать полученные данные при создании функциональных искусственных зубов. В сформировавшемся зубе и периодон-тальной связке присутствуют ткани разного типа, каждая из которых выполняет свою определенную функцию.

Интересна приводимая авторами статистика, подтверждающая актуальность темы исследований: те или иные проблемы с зубами возникают в течение жизни у 85% взрослых европейцев; к 17 годам 7% людей теряют один-два зуба, а после 50 лет - лишается в среднем 12 зубов.

Идеальной заменой выпавшему зубу был бы новый, выращенный в том же месте из ткани самого пациента. Однако долгие годы об этом оставалось только мечтать. Ситуация изменилась лишь недавно, благодаря детальному изучению начальных этапов формирования зубов и успехам в области биологии стволовых клеток (СК) и ТИ.

Сложившийся за миллионы лет эволюции механизм формирования любых органов (в том числе и зубов) начинается еще на эмбриональном уровне. Зарождение зубов происходит в результате взаимодействия между двумя разными типами эмбриональных клеток: эпителиальных (ЭК) и ме-зенхиальных (МК). На первых стадиях существования зародыша ЭК ротовой полости, образующие ее выстилку, посылают первые сигналы клеткам мезенхимы (строящим структуру челюсти и мягких тканей) к началу одонтогенеза. В свою очередь, МК посылают сигнал ЭК: «задача ясна», так инициируется диалог между участниками процесса «возведения» зубов. Задача специалистов в области ТИ - воспроизвести все этапы процесса с их изощренной системой контроля. Процесс передачи сигналов между клетками тканей крайне сложен, поэтому органы (в т.ч. и зубы) нельзя вырастить от начала и до конца in vitro. Ученым вряд ли удастся когда-нибудь полностью воспроизвести условия естественного образования тканей. Но чем больше они узнают о самых ранних этапах их развития, тем скорее сумеют создать «ростки» зубов, имплантировать их в организм и предоставить природе возможность довершить остальное.

Образование зубов сама Природа задумала так:
- Первые намеки на зубы у эмбриона человека появляются на 6-7-й неделе после зачатия, когда начинает угадываться форма головы. На месте образования будущего зуба происходит небольшое уплотнение эпителиальной ткани ротовой полости, и ЭК начинают посылать сигналы клеткам подлежащей мезенхимы. По мере прорастания эпителия в ткань мезенхимы МК посылают ответные сигналы и концентрируются вокруг эпителиального выроста, образуя зачаток зуба.
- К 9-й неделе слой эпителиальной ткани образует структуру в форме перевернутой чаши, которую заполняет мезенхима. В центре чаши появляетсяэмалевый «узелок», который будет служить основным «командным пунктом», откуда будут отдаваться приказы клеткам эпителия и мезенхимы.
- К 14-й неделе формируется «колокол», состоящий из слоя дифференцирующихся клеток, называемых амелобластами (из них позже образуется эмаль) и слоя одонтобластов (прародителей дентина).
- Из ЭК образуется наружная часть, которая прорезывается из десны на 6-8 месяцпосле рождения ребенка.
- Последними появляются корни, формирование которых завершается к моменту прорезывания зубов (6-12 мес. после рождения).

Форма будущего зуба определяется его местоположением. Некоторые посылаемые ЭК сигналы, которые запускают процесс одонтогенеза, участвуют в регуляции работы важной категории генов мезенхимы. Все они содержат специфическую нуклеотидную последовательность (т.н. - гомео-бокс) и способствуют развитию различных органов. При формировании челюсти в определенных ее участках активизируются разные гомеобоксгены, предопределяющие закладку и формирование моляров, npeмоляров, клыков и резцов. Определенные гомеобоксгены экспрессируются в тех клетках мезенхимы, где в будущем должны появиться соответственно запрограммированные по форме зубы самой Природой. Кроме того, сигналы должны поступать к клеткам развивающегося зуба в определенное время. Для завершения формирования зубов необходимы определенные факторы роста и сигналы, поступающие эмбриону от клеток челюсти.

Внимание для интересующихся клеточными биотехнологиями!
Выходит новый научный медико-биологический журнал «Клеточная Трансплантология и Тканевая Инженерия» - подробности см. www.celltranspl.ru.

Исследования по 1-му направлению
Пол Шарп и его коллеги из Королевского Колледжа в Лондоне пытаются воспроизвести в лабораторных условиях естественный рост зуба с эмбрионального уровня. Для этого необходимо выяснить принципы регуляции первых этапов формирования зубов и найти источник клеток, образующих эпителий и мезенхиму ротовой полости зародыша.

Исходным материалом для исследований служат клетки (как СК, так и обычные) эмбрионов мышей и взрослых особей. С их помощью исследователи намереваются выяснить роль клеток разного типа в процессе формирования зубов с начала до конца. Как правило, клетки мезенхимы подвергают центрифугированию, пока они не образуют плотный осадок. Последний покрывают слоем ЭК и в течение нескольких суток культивируют такой «бутерброд», отслеживая активность различных генов, чтобы уловить первые признаки образования зубов. Затем зачатки имплантируют в хорошо снабжаемый кровью орган взрослого животного (например, в почки) и наблюдают за процессом на протяжении 25 суток.

В таких условиях происходит формирование зубов, однако только в том случае, если ЭК взяты от эмбриона, а среди клеток мезенхимы имеется хотя бы небольшое количество СК. Когда вместо клеток мезенхимы были взяты СК костного мозга взрослого животного, из трансплантированного материала также сформировался правильный в структурном отношении зуб. Следовательно, при конструировании зубов эмбриональные клетки мезенхимы можно заменить СК взрослого организма.

С заменой ЭК эмбриона дело обстоит сложнее. Дело в том, что они содержат уникальный набор необходимых для одонтогенеза сигнальных молекул, которые после рождения исчезают из тканей полости рта. Шарп и его сотрудники пытаются найти во взрослом организме эффективные заменители. Они уже получили обнадеживающие результаты, используя комбинацию СК взрослых животных и ЭК полости рта эмбриона.

Очень важно, что образующиеся таким образом зубы имеют нормальный для мышей размер, они окружены костной и соединительной тканями и проявляют первые признаки образования корней. Теперь нужно попробовать получить такие же результаты in vivo, т.е. вырастить зубы там, где им положено быть. У эмбриона челюсти, мягкие ткани, костное вещество и сами зубы развивают одновременно, не подвергаясь никаким аномальным внешним воздействиям. Однако рот взрослого животного представляет собой уже сформировавшуюся конструкцию и неизвестно, будут ли в таких условиях поступать сигналы, необходимые для развития имплантата.

Чтобы прояснить все сомнительные моменты, Шарп изъял зачаток зубов у эмбриона мыши и трансплантировал их в мягкую ткань верхней челюсти взрослого животного между молярами и резцами, где зубы, по идее, не растут. Трансплантат зафиксировали в небольшом надрезе с помощью хирургического клея. После операции мышам давали только мягкую пищу. Через три недели в диастеме прорезались зубы. Они росли в правильном направлении, имели надлежащий размер и прикреплялись к кости с помощью мягкой соединительной ткани.

Т.о., условия, в которые попадает зачаток зуба при трансплантации в ткань взрослого животного, вполне приемлемы для его нормального развития. Однако на пути к искусственному выращиванию человеческого зуба нас, несомненно, ждет еще не один крутой поворот.

Исследования по 2-му направлению
Проведенные учеными многочисленные эксперименты с живыми организмами по выращиванию зубов убедили их в том, что зубная инженерия не может быть успешной, если не будут обеспечены 3 самые важные составляющие:

1. Использование клеток самого пациента.
2. Создание таких условий, чтобы будущий зуб правильно развивался в окружении ткани челюсти взрослого организма, образуя корни, прочно фиксирующие его на месте с помощью периодонтальной связки.
3. Необходимость соответствия формы и размера новой структуры - настоящим.

В конце 1980-х гг. специалист по трансплантации органов Джозеф Ва-канти (Joseph P. Vacant!) из Гарвардской медицинской школы и химик-полимерщик Роберт Лангер (Robert S. Langer) из Массачусетского технологического института провели следующий эксперимент. Они поместили клетки определенной части тела в заранее изготовленную биодеградируемую форму, намереваясь вырастить в ней орган для трансплантации. Ученые опирались на тот факт, что клетки, формирующие ткани живого организма, постоянно обмениваются сигналами и часто перемещаются с места на место в пределах некой образуемой ими трехмерной структуры. Каждая клетка заранее «знает» свое место и роль в будущем организме. Следовательно, если поместить правильно подобранный набор отдельных клеток, полученный путем дезинтеграции ткани, в каркас подходящей формы, то они самоорганизуются и воссоздадут искомый орган.

Первые успешные эксперименты по регенерации кусочков ткани печени из отдельных клеток, проведенные Ваканти и Лангером, послужили стимулом к разработке аналогичных методик для получения других сложных органов - сердечной мышцы, костной ткани и зубов. В 2000 г. Памела Йелик (Pamela C. Yelick) и Джон Бартлет (John D. Bartlet) из Института Форсайта в Бостоне попытались вместе с Ваканти реконструировать зубы свиньи (у этих животных, как и у человека, закладываются два набора зубов - молочные и постоянные). В работе принимал участие и один из авторов статьи - Янг. В качестве исходного материала были взяты непрорезавшиеся третьи моляры шестимесячных поросят. Чтобы получить однородную смесь клеток зубной эмали (происходящих из эпителия) и пульпы (происходящих из мезенхимы), зубы раздробили как можно мельче и затем обработали ферментами. Каркас в форме зуба изготовили из биодеградируемо-го полиэфирного материала и покрыли веществом с хорошими адгезивными свойствами, чтобы клетки легко на нем адсорбировались. Затем в емкость поместили набор клеток и имплантировали его в сальник крысы (хорошо снабжаемую кровью жировую ткань, окружающую кишечник). Выбор места трансплантации крайне важен, поскольку развивающиеся зубы должны иметь необходимые питательные вещества и кислород.

Спустя какое-то время после операции каркас рассосался, вместо него образовалась новая ткань, а через 20-30 недель появилась структура, сходная по форме и составу с настоящим зубом (причем развились все основные его компоненты: эмаль, дентин, пульпа и зачатки корней).

Казалось очевидным, что «зубы» сформировались в организме крысы в результате самоорганизации соответствующих клеток внутри каркаса. Но чтобы исключить элемент случайности, было решено провести еще один эксперимент. Группа ученых из Института Форсайта использовала гомогенат зубной ткани - ЭК и МК, полученные из первых и вторых зубов, а также моляров крыс. На этот раз их культивировали в течение шести суток, и только затем перенесли в каркас и имплантировали. По прошествии 12 недель сформировавшиеся структуры изъяли и тщательно исследовали. И вновь обнаружилось, что внутри формы образовалось нечто вроде зубов с эмалью, дентином и пульпой.

Полученные результаты подтвердили предположение о самоорганизации клеток при формировании зубов. Кроме того, они показали, что предварительное культивирование не оказывает отрицательного воздействия на процесс, что очень важно для конструирования зубов человека, предполагающего использование клеток самого пациента. И, наконец, была продемонстрирована возможность регенерации зубов еще одного млекопитающего.

Ученые из Института Форсайта научились воссоздавать большинство типов тканей зуба, используя в качестве исходного материала соответствующие клетки взрослого организма. Однако, будучи предоставлены самим себе, они структурировались правильно только на 15-20%. Поэтому ученые продолжают работать над созданием прецизионных методов размещения различных типов клеток в матрице, с тем, чтобы получать полноценные зубы.

В то же время, исследователи не исключают возможного участия в формировании зуба СК, которые, возможно, содержатся в зачатках третьего моляра, клетки которого используются для образования новой ткани. Если ученые докажут этот факт, то процесс воссоздания челюсти с использованием матрицы значительно ускорится.

Ближайшие задачи и перспективы
- Разработка простых методов отслеживания процесса воссоздания зубов остается пока проблемой.
- Специалистам по ТИ необходимо в деталях разобраться в природе формообразующих сигналов, чтобы использовать их при конструировании зубов человека. Предсказание и контроль формы и размера зубов - близки к решению. Зачатки моляров и резцов, выращенные в культуре, легко различимы как по внешнему виду, так и по активности их генов, чего нельзя сказать о премолярах и клыках. Зубы, формирующиеся у взрослых мышей из трансплантированных зачатков зубов эмбрионов, соответствовали по форме тем, которые должны были вырасти у них на том же месте. Это свидетельствует о том, что информация о форме будущего зуба уже заложена в нем изначально.
- Все зубы, выращенные в лабораторных условиях, не имели полноценных корней (они образуются в последнюю очередь, уже в ходе прорезывания зубов). Остается неясный момент - сколько времени понадобится на то, чтобы у человека вырос полноценный зуб из имплантата. Известно, что не только молочный, но и второй набор зубов тоже закладывается в период эмбрионального развития, они прорезываются на 6-7-м году жизни, а зубы «мудрости» - на 20-м. Опыты с регенерацией зубов у животных свидетельствуют, что все происходит гораздо быстрее, однако неизвестно, когда процесс завершается, и эмаль полностью затвердевает.
- Поиск легкодоступного источника клеток пациента, которые стали бы приемлемым исходным материалом для будущего зуба. Нужно, чтобы имплантат не вызывал иммунного ответа, кроме того, протезы должны обладать теми же характеристиками. П. Шарп и его сотрудники обнаружили, что вместо ЭК мезенхимы могут быть использованы и соответствующие СК из костного мозга взрослого организма. Заменитель эмбриональных ЭК пока не идентифицирован. Обнадеживает то, что СК обнаружены и в других тканях взрослого организма, которые имеют эпителиальное происхождение (например, в коже и волосах). Вероятно, их можно будет генетически видоизменить так, чтобы они индуцировали сигналы к одонтогенезу. Наиболее подходящим источником необходимых клеток являются сами зубы. Возможно, в них содержатся СК, способные давать начало разнообразным тканям зуба, в т.ч. и эмали. Об этом свидетельствуют и такие факты: при повреждении зуба происходит естественная частичная регенерация дентина и других тканей. Так что - можно предположить, что когда-нибудь новые зубы будут делать путем перекраивания старых.

Материал подготовла Галиной Масис

Литература:
1. Tissue Engineering of Complex Tooth Structures on Biodegradable Polymer Scaffolds. Conan S. Young, Shinichi Terada, Joseph P. Vacanti, Masaki Honda, John D, Bartlett and Pamela С. Yelick in Journal of Dental Research, Vol. 81, No 10, p. 695-700; October 2002
2. Bioengineered Teeth from Cultured Rat Tooth Bud Cells. Monica T. Duailibi, Silvio E. Duailibi. Conan S. Young, John D. Bartlett, Joseph P. Vacanti and Pamela C. Yelick in Journal of Dental Research, Vol. 83, No 7, p. 523-528; July 2004
3. Stem Cell Based Tissue Engineering of Murine Teeth. A, Ohazama, S.A.C. Modino, I. Miletich and P, T. Sharpe in Journal of Dental Research, Vol. 83, No 7, p. 518-522; July 2004