"Методы молекулярной генетики в антропологии" и "Древняя ДНК в антропологических исследованиях"

Сегодня в рубрике "Генетика" мы публикуем выдержки из материалов 
    "Методы молекулярной генетики в антропологии: Анализ днк из древних останков человека как источник новой информации о древнем народонаселении" 
    Авторы: Рычков С.Ю., Наумова О.Ю., Мамонова Н.Н. 
    Институт общей генетики РАН

"Древняя днк в антропологических исследованиях" 
    Авторы: Друзина Е.Б, Бужилова А.П., Макаров Н.А. 
    Научный центр психического здоровья РАМН, Центр генетических идентификаций, Институт археологии РАН

Рубрика с рабочим названием "Генетика" - одна из наших новых рубрик, расширение спектра которых в газете - процесс перманентный. Актуальность и современность рубрик гарантируем. Газета наша живая, формируете ее во многом Вы, наши читатели. Поэтому хотелось бы узнать Ваше мнение - как должна называться такая рубрика. Лучшее присланное нам название будет носить данная "генетическая" рубрика.

Первые сведения о возможности изучения ископаемой ДНК появились в литературе еще в 80-х годах 20 века. Тогда эксперименты по изучению ДНК из различного рода останков живых организмов сводились к попыткам выделения ДНК и анализа состояния молекулы и проводились на различном музейном материале: шкурах животных, египетских мумиях и других подобного рода материалах. В результате этих исследований стало ясно, что практически из любого материала, представляющего собой останки живого организма, возможно выделить некоторое количество молекул ДНК. Так, хотя теоретические расчеты сохранности ДНК и предполагают, что из за воздействия процессов гидролиза и особенно окисления ДНК должна распадаться на отдельные нуклеотиды уже через 10000 лет, Паабо в 1989 году (Рааbо, 1989) выделил ДНК древностью 13000 лет, а Джонсон в 1985 - из зубов, возраст которых оценивался в промежутке 40-53 тыс. лет (Johnson, 1985). Не редкость и древняя ДНК, выделенная из костных останков 8000-летней давности. 
    Молекулярная археология и антропология в последнее десятилетие получили свое развитие на стыке таких, ранее не связанных между собой наук, как молекулярная биология, молекулярная генетика, с одной стороны, и археология, антропология, с другой. Начиная с 1985 года и по 1991 год, основные усилия в исследовании древних нуклеиновых кислот были сосредоточены на выделении ДНК из костных и мумифицированных тканей различной давности. Как показал целый ряд исследований (Рааbо, 1989; Наgelbегg, Сlеgg, 1991), ДНК в останках организмов легко разрушается под влиянием факторов внешней среды и действия микроорганизмов, однако небольшие фрагменты ДНК сохраняются достаточно долго. К самому древнему биологическому материалу, из которого удалось выделить и исследовать древнюю ДНК, надо отнести останки жуков и термитов в янтаре давностью 120-135 миллионов лет (Саno, 1993). При исследовании ДНК из останков древних людей наиболее древними были ископаемый мозг и мумифицированные ткани южноамериканской мумии давностью 7000 и 8000 лет соответственно (Рааbо, 1988; Rogan, Sаlvo, 1990). Однако большинство исследованных останков людей относится к периоду с начала I тысячелетия до н.э. до конца I тысячелетия н. э. (Раlmorotta 1992; Stone, Stoneking 1993). 
    Начиная с 1991 года, стали появляться работы с целью приложения молекулярно-генетических методов к проверке теорий и гипотез о происхождении, миграциях и структуре древних популяций. 
    Учитывая накопленный археологами объем материала, пригодного для выделения из него древней ДНК, с одной стороны, и высокий уровень молекулярно-генетических методик - с другой, в настоящее время появилась возможность такого же систематического и полного анализа древних популяций, как и современных. Результатами такого исследования древних популяций могут стать принципиально новые данные о структуре, внутри- и межпопуляционных связях, этногенезе, миграциях не только популяций человека, но и об эволюции человека как вида. 
    В последние годы в мире, в том числе и в нашей стране, начинают разворачиваться исследования самых разных древних популяций. Для нас, в качестве примера, интересны методики изучения материалов, взятых в процессе археологических раскопок, и исследуемых антропологами. 
    Для молекулярно-генетического анализа останков в качестве источника древней ДНК берутся, чаще всего, зубы (по возможности без следов кариеса - работа №2) или фрагменты костной ткани (работа №1). Группой указанных авторов (работа №1) из костных останков была выделена митохондриальная ДНК (мДНК). Выбор именно этой ДНК не случаен: во-первых, мДНК является естественным маркером женских линий, так как благодаря физиологичским особенностям организма наследуется только по линии матери (Минченко, Дударова, 1990), во-вторых особый мембранный комплекс самой митохондрии способствует лучшей сохранности мДНК по сравнению с ядерной ДНК. Для экстракции мДНК из тел позвонков было высверлено губчатое вещество, во-первых, чтобы предотвратить загрязнение образца современной ДНК, а во-вторых, в связи с тем, что при жизни организма в губчатом веществе находился красный костный мозг - богатая митохондриями ткань и, потому, вероятность обнаружить ДНК в губчатом веществе значительно выше, чем в компакте. Из полученного таким образом порошка мДНК экстрагируется путем вымывания ее в раствор, который смешивается с этиловым спиртом и хлористым натрием, образующим с ДНК нерастворимую в спирте соль натрия. Полученный в результате осадок концентрируется и растворяется в деионизированной воде. Экстрагированная таким образом мДНК подвергалась "амплификации методом полимеразной цепной реакции (ПЦР), в основе которого лежит имитация естественного процесса репликации ДНК. В реакционную смесь вносится древняя ДНК в качестве матриц для синтеза цепей-копий, ДНК-полимераза, выполняющая синтез копии с матричной последовательностью нуклеотидов и искусственно синтезированные праймеры, позволяющие выбрать из всей массы выделенной мДНК интересующий фрагмент. Праймеры имеют "липкий" конец, к которому будут присоединяться последующие нуклеотиды комплиментарно соответствующей матричной последовательности древней мДНК. Так как этот процесс является цепной циклической реакцией, то выход конечного продукта определяется как количество матричных цепей в степени количества циклов, позволяя в итоге получить порядка 0.5 микрограмм мДНК. (РСR Ргоtосоls, 1990). 
    Но так как, благодаря физиологическим особенностям организма, мДНК наследуется только матрилинейно, то совокупность сайтов рестрикции - митотип, оказывается еще и маркером конкретной женской линии, в которой передается именно этот, конкретный набор сайтов рестрикции, отличающий данную материнскую линию от других возможных. Общее же число выявленных различающихся митотипов маркирует число независимых женских линий, восходящих к проматерям - основательницам данной популяции. Исследуя останки по выделенным митотипам как маркерам для отслеживания внутри и межпопуляционных связей - определяют их принадлежность к той или иной материнской линии. Благодаря накопленной учеными различных стран мира базе данных, составленной по большому объему различных исследованных погребений широкого географического охвата , ученым доступно определять принадлежность к тому или иному роду, семейной группе, популяции, судить о степени родства, структурах семейных отношений, численности (по частоте выявления ), их межгрупповых взаимоотношениях. Используя новейшие методы молекулярной генетики ученым еще предстоит установить степень генетической преемственности древнего и современного человека. Результатами таких исследований древних популяций могут стать принципиально новые данные о структуре, внутри- и межпопуляционных связях, этногенезе, миграциях не только популяций человека, но и об эволюции человека как вида. 
    Метод ПЦР представляет собой многократное увеличение числа копий (апмлификация) специфического участка ДНК, катализируемое ферментом ДНК- полимеразой. Праймеры - олигонуклеотидные затравки, обеспечивающие комплементарное достраивание цепочек специфических ДНК внутри заданных ими участков, являясь "стартовыми" блоками на левой и правой границах специфического фрагмента. 
    В качестве источника ДНК (работа №2) были взяты зубы без следов кариеса и фрагменты костной ткани из останков людей, найденных в нескольких археологических памятниках. 
    ДНК из измельченной зубной и костной ткани выделяли по стандартной методике с экстракцией фенол-хлороформом и последующим осаждением изопропанолом (Маniatis, 1982). В этой работе определялся пол останков людей, найденных при археологических раскопках. ДНК, выделенная из их зубной ткани, использовалась для амплификации локусов ядерной ДНК, расположенных на половых хромосомах для определения пола и фрагментов митохондриальной ДНК, с целью выявления в будущих исследованиях древних материнских линий. 
    Материал подготовлен Галиной Масис.

От редакции: Уважаемые читатели! Просим Вас сообщить нам Ваше мнение о том, какой должна быть рубрика "Генетика", какими материалами в ней можно было бы Вас заинтересовать. Присылайте свои пожелания, если у Вас есть какие-либо новости, интересные заметки на эту тему, присылайте их в наш адрес. Принимаются на рассмотрение варианты оригинального названия генетической рубрики. Заранее благодарны за помощь.